Proces proizvodnje elektroforeze u poliakrilamidnom gelu (PAGE) uglavnom uključuje korake kao što su priprema gela, postupak elektroforeze, bojenje i promatranje rezultata.
Priprema gela Priprema gela za odvajanje (10%): Pomiješajte 0 ml ddH₂O, 3 mL 30% osnovnog gela, 5 mL 5 mol/L Tris-HCl, 1 mL 10% SDS i 1 mL 10% AP, dodajte 10 μL TEMED-a da zatvorite dno, a zatim dodajte 4 µL TEMED-a i dobro promiješajte. Ulijte ovu smjesu između staklenih ploča, zatvorite vrh vodom i pričekajte 30~60 minuta da se gel potpuno polimerizira.
Priprema gela za slaganje (4%): Pomiješajte 4 ml ddH₂O, 33 ml 30% osnovnog gela, 25 ml 1 mol/L Tris-HCl, 0,2 ml 10% SDS i 0,2 ml 10% AP, dodajte 2 μL TEMED-a i odmah dobro promiješajte. Odlijte vodu na gelu za odvajanje, dodajte ovu smjesu i odmah umetnite češalj između staklenih ploča, čekajući 15-30 minuta da se gel za slaganje potpuno polimerizira.
Postupak elektroforeze Obrada uzorka: Pomiješajte uzorak s jednakom količinom 2XSDS pufera za punjenje, zagrijavajte na 100 stupnjeva 3-5 minuta, a zatim centrifugirajte na 12 000 okretaja u minuti 1 minutu i uzmite supernatant za SDS-PAGE analizu.
Učitavanje: Uzmite 10 μL induciranih i neinduciranih uzoraka i dodajte ih u skup uzoraka te dodajte 20 μL standarda proteina niske molekularne težine kao kontrolu.
Elektroforeza: dodajte 1X pufer za elektroforezu u spremnik za elektroforezu, spojite napajanje, održavajte napon gela za slaganje na 60 V, a napon gela za odvajanje na 100 V. Kada bromofenol plavo dosegne dno spremnika za elektroforezu, zaustavite elektroforezu (oko 3 sata).
Bojanje i promatranje rezultata
Bojanje: Uklonite gel sa staklene ploče i obojite ga Coomassie Brilliant Blue otopinom za bojenje 4 do 6 sati na sobnoj temperaturi. Odstranjivanje boje: Stavite obojeni gel u otopinu za odstranjivanje boje i odstranjujte je nekoliko puta dok proteinska traka ne bude jasno vidljiva. Promatranje rezultata: Nakon odbojavanja, gel se može fotografirati i spremiti. Nakon dovršetka koraka odbojavanja, stavite gel ispod sustava za obradu slike za fotografiranje i spremite rezultate na disketu.